王舒然综述 孙长颢审校哈尔滨医科大学公共卫生学院;营养与食品卫生教研室，哈尔滨 １５００８６
维生素Ｄ类是指含环戊氢烯菲环结构、并具有钙化醇生物活性的一大类物质。１９１９年Ｍｅｌｌａｎ发现了维生素Ｄ２。２０世纪６０年代中叶发现维生素Ｄ的活性形式是１２５ＯＨ２Ｄ３。它作用于小肠、肾、骨等靶器官，参与维持细胞内、外钙浓度，并调节钙磷的代谢。此外，它还作用于其它很多器官，如心脏、肌肉、大脑、造血器官和免疫器官，参与细胞代谢或分化的调节。
维生素Ｄ的作用大部分是通过活化细胞核内受体，即维生素Ｄ受体ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＶＤＲ 来实现的。ＶＤＲ的配体为１２５ＯＨ２Ｄ３，受体与配体相结合形成激素受体复合物，再与细胞核中心的维生素Ｄ反应元件相结合，激活或抑制靶基因，从而发挥其生物学作用。
１ 维生素Ｄ受体的结构
ＶＤＲ属于甲状腺素、皮质类固醇激素等核受体超家族成员。ＶＤＲ在序列和结构上与包括视黄醛、甲状腺激素、过氧化物酶体增殖剂激活受体的亚家族有很大的相似性。研究证实人ＶＤＲ基因定位在第１２号染色体上，由１１个外显子和数个内含子组成，长约７５ｋｂ，蛋白质由４２７个氨基酸组成。从氨基端到羧基端一般可分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ等６个功能区。
ＡＢ区是不依赖配体的细胞、组织特异性的转录激活自调节功能区ＡＦ１。人的ＶＤＲ ＡＢ区大约由２４个氨基酸残基组成。在这个域没有发现什么功能。
Ｃ区：ＤＮＡ结合结构域ＤＢＤ，参与ＤＮＡ顺序识别，也部分参与二聚体界面的形成。该区域高度保守，人、大鼠和鸡ＶＤＲ ＤＢＤ的同源性为９８．１５％。
Ｅ区：该区相对较大并且功能较多：参与结合配体，因而被称为配体结合结构域ＬＢＤ；与ＲＸＲ形成二聚体；形成依赖配体的转录激活或抑制功能区ＡＦ２。此外，Ｅ区对ＤＮＡ的识别也有协同作用。
Ｄ区和Ｆ区：这两个区域的功能不详。Ｄ区可能是一个铰链区，主要是调节受体的柔韧性，可能与核定位有关。
２ ＶＤＲ调控钙结合蛋白基因
ＶＤＲ调控的基因很多，大多数是骨代谢方面的基因４。在此我们以钙结合蛋白基因为例介绍ＶＤＲ对基因的调控。
钙在体内含量仅次于氧、碳、氢、氮，约占人体的２％。钙吸收是一复杂的生理、生化过程，包括主动转运和被动扩散两种。机体摄入钙少时主动转运则占主要。钙的主动转运需要维生素Ｄ和钙结合蛋白的协助。
Ｗａｓｓｅｒｍａｎ等首先证实佝偻病小鸡用维生素Ｄ治疗后，有特异性钙结合蛋白（ＣａＢＰ）的形成。这种维生素Ｄ诱导的ＣａＢＰ已在十几种动物中发现，存在种属特异性。人肠钙ＣａＢＰ的分子量是１２０００～２１０００，它与钙有高度亲和力，结合钙的能力约为２×１０－５Ｍ－１，ＣａＢＰ高度集中在杯状细胞和小肠刷状缘区的吸收细胞上。
在肠的不同部位，肠ＣａＢＰ水平和钙吸收率相一致，以十二指肠最高，空肠其次，回肠最低。此外，肾、下丘脑、大脑皮质、肾上腺、甲状旁腺等组织也存在ＣａＢＰ。ＣａＢＰ在维生素Ｄ调节的肠钙转运的过程中起着重要作用。
哺乳动物能合成两种ＣａＢＰ，即存在于肾脏和中枢神经系统的ＣａＢＰＤ２８Ｋ和在小肠的ＣａＢＰＤ９Ｋ 。给维生素Ｄ缺乏的大鼠和小鸡注射１２５ＯＨ２Ｄ３引起小肠粘膜和肾脏细胞中ＣａＢＰ ｍＲＮＡ的快速合成和ＣａＢＰＤ９Ｋ ｍＲＮＡ的积聚。
应用ＣａＢＰＤ９Ｋ ｃＤＮＡ探针技术从大鼠基因库中克隆出一个３０ｋｂｐ的基因片段，ＣａＢＰＤ９Ｋ基因就位于该片段的中部位置。ＣａＢＰＤ９Ｋ基因长２．５ｋｂｐ，含３个外显子和两个内含子，第一个外显子仅含有一个５＇端未翻译的区段，第二个外显子编码第一个钙结合位点，第三个外显子编码第二个钙结合位和３＇端未翻译区段，每个钙结合的结构域分别由单独的外显子编码。应用Ｓ１核酸酶切图谱和引物延伸法确定了转录的起始位点，从帽的位置上游３１ｂｐ有一个ＴＡＴＡＡＡ区，翻译起点上游是一个ＣＣＡＡＴ盒，一个Ａｌｕ样序列和ＡＣ２５，ＡＧ２３序列共同构成了第２个内含子，重复序列构成帽子上５＇端的５ｋｂｐ和３＇端。对比研究发现ＣａＢＰＤ９Ｋ的基因序列同ＣａＢＰＳ１００基因更相似。而且，ＣａＢＰＤ９Ｋ的氨基酸序列也已确定。
在１２５ＯＨ２Ｄ３缺乏的条件下，加入１２５ＯＨ２Ｄ３ １ｈ后使胚胎十二指肠上皮细胞的ＣａＢＰＤ９Ｋ ｍＲＮＡ增加２倍，２４ｈ后ＣａＢＰ增加２．５倍。
缺维生素Ｄ大鼠接受维生素Ｄ治疗后，在小肠和肾脏ＣａＢＰ ｍＲＮＡ升高的同时，维生素Ｄ受体ｍＲＮＡ却无变化，而地塞米松可以升高维生素Ｄ受体ｍＲＮＡ，同时降低ＣａＢＰＤ９Ｋ的水平。
对基因突变技术培养的无牙鼠模型的研究发现，该鼠不仅血中１２５ＯＨ２Ｄ３水平升高，而且小肠和肾的ＣａＢＰ水平升高，二者呈正相关。
３ ＶＤＲ对基因表达的调控机制
当ＶＤＲ与其配体１２５ＯＨ２Ｄ３结合后，引起ＶＤＲ构象改变，并与未结合配体的ＲＸＲ形成异源二聚体ＶＤＲＲＸＲ。后者再作用于维生素Ｄ靶基因启动子区上的维生素Ｄ反应元件，并释放辅助抑制因子复合物，同时募集一些辅助激活因子及通用的转录因子，从而共同形成活性转录复合体。在上述过程中，人们推测１２５ＯＨ２Ｄ３可能是诱导ＶＤＲＥｓ在其螺旋结构１２的位置上发生分子内折叠等微小的变化，如关闭配体结合的“口袋”，同时暴露ＶＤＲＡＦ２位点，才能使ＶＤＲ与辅助激活因子相互作用；同样，ＲＸＲ ＡＦ２位点也必须暴露，以便与辅助激活因子相互作用。这些辅助激活因子可称为“搭桥”因子，即将ＶＤＲＲＸＲ已与ＶＤＲＥ结合与转录起始复合物前体连接起来，并起到稳定转录起始复合物前体的作用；这些辅助激活因子属于类固醇受体辅助激活因子家族，并且具有或兼具有组蛋白乙酰基转移酶活性，可使组蛋白在维生素Ｄ靶基因附近就与ＤＮＡ分离，从而有利于其进入转录过程。除上述间接作用外，现已证明ＶＤＲ与转录因子ＴＦＩＩＢ 之间存在高度特异的直接联接。ＶＤＲ还可通过转录因子ⅡＢ直接作用于转录起始复合前体，以便进入转录过程维生素Ｄ调节转录的整个过程见图１。
辅助抑制因子可募集组蛋白脱乙酰基酶，并与类固醇受体结合，使该受体处于失活状态，同时使染色质处于转录抑制状态。视黄酸和甲状腺素受体的抑制介质可与ＶＤＲＲＸＲ相互作用，从而抑制转录；ＳＵＧ１是一种２６Ｓ的蛋白水解酶，它的亚单位可与辅助激活因子共同竞争结合ＶＤＲ ＡＦ２位点，从而抑制转录。另外，ＳＵＧ１可直接降解ＶＤＲ。其它还有一些因子如钙网织蛋白一种多功能钙结合蛋白和翻译调节因子Ｌ７，均可与ＶＤＲ相互作用，阻止其与ＤＮＡ结合。在核受体蛋白信号调节途径中，辅助激活因子和辅助抑制因子复合物之间的平衡决定了ＤＮＡ的转录是开始还是关闭。
磷酸化与去磷酸化是许多转录因子活性调节的一种方式。人类第２０８位丝氨酸被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化后引起ＶＤＲ转录活性增加，而第５１位的丝氨酸被蛋白激酶Ｃ磷酸化后则导致ＶＤＲ与ＶＤＲＥ相互作用的减低，但是这些作用均与ＶＤＲ同ＤＮＡ的结合无关。因此，认为ＶＤＲ的磷酸化不是ＶＤＲ发挥其功能所必须的步骤。磷酸化对ＶＤＲ转录活性的意义目前仍难以确定。
４ 实际意义
通过维生素Ｄ调节基因表达的研究，除了了解维生素Ｄ传统功能的机制外，还发现维生素Ｄ能调节许多基因表达，并具有许多新的功能。
在传统的靶组织中发现了一些新的维生素Ｄ调节基因，如发现了锁骨－颅骨发育障碍基因的一个新的转录因子Ｏｓｆ２ｃｂｆａｌ。在对破骨细胞形成研究中，发现了两个新的维生素Ｄ调节基因。这些新基因的发现，进一步加深了对维生素Ｄ生理功能的理解。此外，在非传统的靶组织中，也发现了维生素Ｄ调节的基因。如１２５ＯＨ２Ｄ３抑制细胞因子ＩＬ２、ＩＬ８和ＩＬ１２的转录过程。
对维生素Ｄ调节基因表达机制的进一步研究不仅有助于理解ＶＤ生理功能的作用机制，而且有利于发现维生素Ｄ新功能及其在预防和治疗疾病方面新的应用价值。
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