李 颖综述 孙长颢审校哈尔滨医科大学公共卫生学院;营养与食品卫生教研室,哈尔滨 150086
随着分子生物学技术发展,钙离子对基因表达调控研究得到不断扩展。由于细胞内钙离子(Cai2+)参与众多基因的表达调控而倍受关注,从细胞内钙信号产生,Cai2+与钙调素(calmodulin,CaM)等结合,Ca2+.CaM依赖性蛋白激酶介导的磷酸化级联反应,以及转录因子与DNA反应元件的相互作用等过程已被阐明。人们早已发现与外界环境密切相关的细胞外钙(Cao2+)水平变化,可直接调控某些基因表达。1993年Brown 等发现细胞外钙敏感受体(CaR)基因,填补了细胞外钙调节基因表达的重要空缺。Cao2+可以作为第一信使,通过CaR与G蛋白偶联,将细胞外信息传入胞内,使细胞内Cai2+ 升高,磷脂酶C(PLC)活性增强或cAMP水平下降,进而调控基因表达。
1 CaR的结构和功能 CaR包含一个600个氨基酸的NH2末端细胞外区域(ECD);一个由250个氨基酸组成的7个跨膜区域(TMD)的核心区域,该区域是G蛋白偶联受体GPCR超级家族的特征;和一个大的200个氨基酸的细胞内COOH末端尾。该受体的ECD含有多个N糖基化位点,它的细胞内区域由3个细胞内环(ICL)和COOH尾组成,包含有几个蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点的共有序列,而且PKA位点存在于目前为止所研究的所有物种中(除牛CaR外)。已发现PKC磷酸化位点可调节受体活性,而PKA位点生理作用还不清楚(见图1)。
2 CaR介导的信号传导通路 CaR作为GPCR家族的成员,通过与G蛋白偶联将细胞外信号传入细胞内。CaR与配体(Cao2+)结合后即与膜上的偶联蛋白结合,使其释放活性因子,再与效应器发生反应。 稳定表达CaR的HEK293细胞可激活磷脂酶C、A2、D,而不表达CaR的HEK293细胞中,CaR激动剂对这些磷脂酶没有作用。牛甲状旁腺细胞中,CaR激动剂能刺激这3种磷脂酶,推测是通过CaR激活的。甲状旁腺中,CaR介导PIPLC的激活,可能由Gq11参与的G蛋白介导过程,因此该作用不会被百日咳毒素阻断。然而AtT20细胞中,CaR介导PIPLC激活受预处理的百日咳毒素所抑制。因此,CaR可能利用不同的信号途径,包括百日咳毒素敏感性或百日咳毒素不敏感性G蛋白,激活PIPLC信号系统,使细胞内钙水平升高,从而产生细胞反应或调解基因表达。 CaR稳定转染的甲状旁腺细胞和HEK293细胞中,高Cao2+可抑制cAMP生成,提示可能是由Gi直接介导腺苷酸环化酶的抑制作用。该抑制作用同样存在于小鼠髓袢升支粗段,然而,最近对大鼠肾脏的髓袢升支粗段研究表明,高Cao2+诱导的cAMP抑制作用,是由花生四烯酸参与的间接百日咳毒素敏感性作用机制。这可能通过Cao2+诱导CaR刺激PLA2活性增加,从而抑制cAMP的生成来实现的。
3 Cao2+对甲状旁腺激素基因的转录调节 3.1 甲状旁腺激素基因结构与功能 研究表明Cao2+可通过负向基因调节机制调控甲状旁腺激素(PTH)基因表达。人的PTH(hPTH)基因含有2个内含子,3个外显子。外显子1编码5非编码区,外显子2编码前导肽,外显子3编码激素原、切割位点、PTH序列和3非编码区。hPTH基因有2个顺式负向转录元件(oligoA和oligoB),存在于启动子上游的-2.4kbp~-3.6kbp之间。这两个元件以序列特异性方式与转录因子结合,从而抑制hPTH基因的转录。oligoA以双向行使功能,而oligoB仅以原有的方向行使功能,它们都距离转录起始点很远,因此具有沉默子特征。hPTH基因的这两个顺式负向转录元件被称为负向Ca2+反应元件(negative Ca2+ responsive elements nCaRE)。oligoB包含一个回文序列TGAGACAGGGTCTCA,此序列可与二聚体的核蛋白相结合。
3.2 参与Cao2+调节PTH基因的转录因子 研究表明,氧化还原因子蛋白1(ref1)以序列特异性和Cao2+浓度依赖性方式与nCaRE(oligoA和oligoB)结合,从而起到负向调节PTH基因表达的转录因子的作用。人类ref1 cDNA编码318个氨基酸,存在于细胞核中,属于该信号的核受体成员之一。另外ref1还可通过改变几个转录因子如AP1、Myb和NFкB的氧化状态,增强它们与DNA 结合活性。 最近研究表明,cAMP应答元件结合蛋白CREB和它的同系物p300具有辅助激活因子作用,CBPp300本身并不与DNA结合,而是通过与序列特异性转录因子(TF),如ref1、p53、核受体进行结合,作用于DNA。CBPp300是通过乙酰化核小体的组蛋白使染色质解聚来激活转录。不仅如此,它也可乙酰化TF,因此被称为因子乙酰化转移酶。Cao2+可激活转录协同子p300,活化的p300使ref1的Lys6或Lys7位点发生乙酰化,从而增强ref1与nCaRE的结合活性,起到PTH启动子阻遏物的作用。体内研究表明,ref1同Ⅰ型组蛋白脱乙酰基酶稳定地相互作用。乙酰化ref1可增强ref1与Ⅰ型组蛋白脱乙酰基酶形成复合物,从而增强与PTH启动子的结合活性,表明乙酰化ref1在转录调节中起重要作用。 研究发现,ref1与nCaREs结合还需要Ku抗原KuAg的参与,ref1和KuAg共同作用于nCaREs起到nCaREB的作用。KuAg含p70和p80两个亚基,在DNA双链断裂修复中起重要作用。研究表明,KuAg的p70亚基的亮氨酸拉链(残基395399)具有共有序列AA KERCR,该序列可与ref1相互作用,提示KuAg可能通过该共有序列与ref1结合来发挥重要作用。 总之,升高的Cao2+与甲状旁腺细胞表面的CaR作用,促进CaR与G蛋白偶联,使Cai2+水平升高,激活细胞内钙信号系统,经过一系列级联反应,信号传递入细胞核,使p300活化,乙酰化的ref1与KuAg作用,最终与nCaRE(oligoA和oligoB)结合,抑制PTH的转录。
4 Cao2+调节HGaRG基因的转录 动脉高血压的发生与钙代谢紊乱有关,这一现象不仅在人群流行病学研究中得到证实,而且还在高血压动物模型中得到验证。在遗传性或自发性高血压大鼠中,肾脏和小肠存在钙代谢紊乱,表现为尿钙增加,小肠钙吸收下降,血中钙水平降低,而循环中血小板、淋巴细胞和血管平滑肌细胞的细胞质中,钙离子的水平升高。可见,在自发性高血压大鼠及低肾素性高血压患者中,细胞外钙和细胞内钙之间存在负相关。 2000年Solban等从自发性高血压大鼠中克隆了一个新的基因。在自发性高血压大鼠甲状旁腺和其它几个组织中,新基因的mRNA水平和蛋白质水平显著高于血压正常的对照大鼠,且降低细胞外钙水平导致该基因mRNA水平升高,因此将该基因命名为高血压相关性钙调节基因(hypertensionrelated calciumregulated gene,HGaRG)。该基因由1100个碱基对组成,含有一个224个密码子的cDNA开放读码框架。主要在心脏、胃、空肠、肾脏、肝脏、和肾上腺中进行表达,与CaR表达的组织分布相一致,提示HGaRG受Cao2+水平调控,并由CaR所介导。 研究发现,在缺血性损伤肾脏模型中,上皮细胞增生肥大,细胞分化受到抑制,HCaRG mRNA水平升高。当进行缺血再灌注后,上皮细胞分化活跃,HCaRG mRNA水平迅速下降。综合上述研究结果,HCaRG可能在控制肾脏上皮细胞生长和分化中起重要作用,然而其分子机制还不清楚。心房利钠利尿素具有很强的利钠和利尿的功能,可使血压显著降低。当HCaRG表达增加时,心房利钠利尿素水平升高,提示HCaRG 可能具有拮抗心房利钠利尿素功能的作用。 HGaRG水平升高同动物遗传性高血压相一致,而且降低细胞外钙水平会使其转录和表达水平升高,提示HGaRG调节异常可能是由于高血压大鼠细胞外钙水平下降,或对细胞外钙水平产生异常反应,使HCaRG表达增高,引发肾脏增生肥大,并对心房利钠利尿素产生拮抗作用,从而导致血压升高。有关HgaRG和高血压的关系有待于进一步的研究。
5 钙对基因表达调控的意义 钙作为细胞信号传导物质时,一般认为是非营养、非能量的信息过程的一种中介物。实际上,人们最初对钙的认识是它所具有的营养素功能,作为构成机体的结构性元素,儿童钙缺乏会导致佝偻病,对于成人和老年人会产生骨质疏松。钙作为营养素其功能还不仅如此,近年来的流行病学调查发现,膳食钙的摄入还与高血压、肥胖、高血脂和胰岛素抵抗密切相关。自发性高血压大鼠中克隆的HgaRG基因,一方面证实了通过膳食钙调控基因表达,一方面为人们将来防治高血压提供了思路和依据。 这些研究提示,钙作为营养素和具有信号功能的非营养素之间并没有界限。确实随着研究的不断深入,人们发现钙不止作为细胞内的第二信使而起作用,以及在细胞核中直接激发信号的级联反应起到第三信使的功能,而且CaSR基因的发现,使人们认识到细胞外钙可调控甲状旁腺激素的分泌,使之具有第一信使的功能。这些发现拓宽了我们对钙生理功能的认识。以往预防医学领域更注重钙作为营养素的功能研究,而起信号传导作用、非营养素功能的钙研究被认为是基础医学范畴。随着学科之间的相互渗透,应运而生一些交叉学科如,分子流行病学、分子营养学,我们相信在这些理论的支持下,及分子生物学技术的发展,终将会揭示钙作为膳食的营养成分,一种外界的刺激,通过怎样的途径调控基因的表达,从而调节血压、体重、胰岛素抵抗这些占人类疾病谱重要位置的慢性疾病的发生,最终达到控制和预防这些疾病的目的。这在预防医学领域乃至整个医学界都将具有重大意义,并将产生深远的影响。这也是作子分子营养学关注钙对基因表达调控机制的意义所在。
参考文献:
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