单毓娟综述 孙长颢审校哈尔滨医科大学公共卫生学院,营养与食品卫生学教研室,哈尔滨 150086) 蛋白质是构成生物体的基本成分,无论是简单的低等生物,还是复杂的高等生物,都毫无例外地需要蛋白质来维持代谢和生命。蛋白质在生命活动中的重要功能取决于它的化学组成、结构与性质。氨基酸是蛋白质的基本构成单位,是合成蛋白质、许多激素的前体并具有生糖、生酮等作用。近年研究发现,氨基酸不仅可作为信号传导途径的传递因子或前体物,还可作为调节细胞生物学过程的一种营养信号分子。随着分子营养学概念的提出,营养素与基因之间的相互作用关系无疑就成为分子营养学的研究热点。膳食中的许多营养素如碳水化合物、脂肪酸、固醇、矿物质、维生素均参与机体内基因表达的调控。膳食中另外一种重要的宏量营养素——蛋白质(氨基酸),它与基因表达关系的研究正受到越来越多的关注。
1 氨基酸在转录水平上对基因表达的调控
氨基酸对基因表达调控的研究始于原核生物酵母。目前,已在酵母体内发现多种氨基酸反应体系,根据其作用的基本原理,归纳为一般调控过程(general control process)和特异调控过程specific control process两大类。在哺乳动物体内,氨基酸对基因表达的调控过程较酵母复杂得多,如:某种必需氨基酸缺乏既能增强一些基因的表达,也能抑制另一些基因的表达。氨基酸对基因表达的调控具有独特之处:它能同时在转录水平和翻译水平调控基因表达。转录水平的调控是大多数营养素调控基因表达的主要方式。研究证实:氨基酸水平的变化可影响许多基因的转录过程。在分子水平上研究较为透彻的是CHOP基因和ASNS基因。 1.1 CHOP基因 CHOP基因即CEBP同源蛋白(CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白,CCAATenhancer binding protein homologous protein)。CHOP基因是生长抑制和DNA损伤所诱导(growth arrest and DNA damage,GADD)的基因家族成员之一,也被称为GADD153基因。CHOP基因定位在人12号染色体上 即12q13.1q13.2。基因全长3kb,为单拷贝基因,包括4个外显子和3个内含子。通常CHOP基因只在细胞内低水平表达,几乎检测不到。当细胞受到某些刺激时,CHOP基因的表达才会迅速被诱导。CHOP基因与细胞能量代谢、增生、分化及特征性基因的表达有密切关系。在众多氨基酸调节基因中,CHOP基因是为数不多的几个被深入到分子水平研究的基因之一。 CHOP基因是内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response,ERSR)、氨基酸反应(amino acid response,AAR)通路的靶基因。当胞浆内蛋白质多肽发生的错误折叠过多而引起堆积时,CHOP基因上的内质网应激反应元件(endoplasmic reticulum stress response element ERSE)活化,诱导CHOP基因转录。但氨基酸缺乏对CHOP基因的调控与ERSE无关,而是通过另外一个特异的氨基酸调节元件(amino acid regulatory element,AARE)来实现的。不仅如此,CHOP基因对不同氨基酸缺乏的反应性也不同。当限制体外培养的人宫颈癌细胞(HeLa)和人肝癌细胞(HepG2)丙氨酸或其它一些非必需氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸的摄入时,并不影响CHOP mRNA的表达;但是当限制亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸这些必需氨基酸的摄入时,CHOP mRNA的表达增加。深入研究表明:这种差别与CHOP基因启动子的活性有密切关系。在CHOP基因启动子区段第-313~-295核苷酸上有一个顺式作用元件,即AARE,它在氨基酸缺乏引起的CHOP基因转录中起关键作用。 综上所述,当氨基酸缺乏或内质网应激反应时,通过氨基酸反应通路或内质网应激反应通路将这些信息传递给相应的转录因子,然后这些转录因子再特异地与CHOP基因启动子上的顺式作用元件结合,调控CHOP基因的转录。 1.2 ASNS基因 ASNS(asparagine synthetase,ASNS 或AS)基因即天冬酰胺合成酶基因,主要催化谷氨酰胺和天冬氨酸合成天冬酰胺。ASNS基因是哺乳动物体内普遍表达的看家基因。1989年,Zhang 等分离了人类ASNS基因。该基因全长35kb含有13个外显子。1994年,Heng等发现ASNS基因定位于人7号染色体上,即7q21.3。Kilberg工作小组采用足迹法(footprinting)鉴定了ASNS基因的启动子序列,发现在其启动子上有6个独立的蛋白结合位点,仅有1个位点未参与营养素对ASNS基因的调控。在这5个参与营养素调节的蛋白结合位点中,3个GC盒(即GCⅠ、GCⅡ、GCⅢ)保证自身转录过程的顺利进行并放大氨基酸缺乏引起的ASNS基因活化的信号。另外2个结合位点分别为营养素感受反应元件(nutrientsensing response element,NSRE)1和2,即NSRE1和NSRE2。 NSRE1位于ASNS基因启动子近端第-68~-60核苷酸之间,其核心序列为5’TGATGAAAC3’,该序列与CHOP启动子上的AARE核心序列非常相似;NSRE-1的功能也与CHOP基因的AARE极其相似,只是不能象AARE那样独立发挥作用。 ASNS基因特别是其ASNS mRNA对细胞所处的营养状态(如氨基酸或碳水化合物缺乏)非常敏感。与CHOP基因相同的是,ASNS基因也是AAR通路和ERSR通路的共同靶基因,但与CHOP基因不同的是,这两条通路上,ASNS 基因都是通过其启动子上共同的顺式作用元件即NSRE1和NSRE2来发挥作用的。缺乏天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺,ASNS mRNA水平升高,这与ASNS基因相关的碱性(区亮氨酸)拉链basic regionleucine zipper bZip 转录因子家族成员ATF4、CEBPβ和ATF3 在mRNA水平上表达增加有关。 总之,氨基酸缺乏和各种应激刺激时,可能通过多种机制诱导ASNS基因相关的转录因子ATF6、ATF4、CEBPβ and ATF3的转录(可能还有翻译水平上的调控),然后作用于ASNS基因启动子上的NSRE1和NSRE2,诱导 ASNS 基因表达。
2 氨基酸在翻译水平对基因表达的调控
氨基酸除在转录水平上对基因进行调控外,更重要的是,它还在翻译水平上对基因进行调控。蛋白质的翻译过程是一个复杂的、受许多蛋白(因子)调控的生物学过程。目前的研究结果提示:氨基酸在翻译水平上对基因的调控主要与翻译起始过程相关蛋白的磷酸化有关。 2.1 真核生物起始因子的磷酸化 真核生物起始因子2(eIF2)是一个由α、β、γ亚单位组成的三聚体。α亚单位在第51位丝氨酸残基上的磷酸化,是控制整个蛋白质合成的重要环节。在哺乳动物体内,该磷酸化过程至少由以下4种eIF2α激酶介导:血红素调节翻译抑制因子(heme-regulated translational inhibitor HRI)、双链RNA依赖蛋白激酶(doublestranded RNAdependent protein kinase PKR)、胰腺eIF2α激酶PKR样内质网激酶(pancreatic eIF2αkinasePKRlike endoplasmic reticulum kinase PEKPERK)、酵母GCN2(general control nonderepressing GCN2)的哺乳动物同系物(mGCN2)。当细胞受到某些特异的刺激作用(如应激、病毒感染、氨基酸缺乏等)时,这些激酶就以单独联合作用的方式,诱导eIF2α51位丝氨酸残基的高磷酸化。eIF2α高磷酸化后,使起始因子mettRNAi不能结合到40S核糖体的亚单位上,影响蛋白质合成的进程。eIF2α高磷酸化一方面能抑制翻译起始因子与40S核糖体亚单位的结合;另一方面,还通过其他翻译起始因子(如eIF2B),控制整个蛋白质的合成过程,如在翻译起始,起始因子mettRNAi结合到40S核糖体亚单位上,与eIF2和GTP形成四聚体。当翻译起始过程完成后,eIF2就以eIF2GDP二聚体的形式释放出来,为使eIF2能在下一个循环中发挥作用,GDP必须转换成GTP。这种鸟嘌呤核苷酸的交换反应是在另外一个起始因子eIF2B的催化下完成的。但如果此时eIF2α处于磷酸化状态,那么它就与eIF2B形成一个沉默型的复合物,使mettRNAi不再与40S核糖体亚单位结合,最终使蛋白质的合成过程无法循环下去。如有研究表明,当必需氨基酸缺乏时,eIF2B的活性能控制蛋白合成的总体速度。 2.2 mTOR对eIF4E结合蛋白1、eIF4G磷酸化的调控 作用 eIF4E结合蛋白1、核糖体蛋白S6、eIF4G是参与mRNA与40S核糖体亚单位连接过程中的3个蛋白,它们都是TOR(target of rapamycin TOR)蛋白激酶通路的下游靶点。mTOR通过以下途径调节蛋白质的合成:使mRNA翻译抑制因子如真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBP1)磷酸化而失活,使S6K1磷酸化而激活。mTOR活性受营养素、生长因子、能量代谢的调节。在酵母和哺乳动物体内,TOR(或mTOR)的主要功能是协调营养素利用与细胞生长、增生之间的关系。在哺乳动物体内,mTOR还能调节mRNA与40S核糖体亚单位的结合。 2.2.1 eIF4E结合蛋白1(4EBP1)的磷酸化 在翻译起始阶段,mRNA与翻译起始因子复合体eIF4F首先结合,形成eIF4F·mRNA复合体,再与40S核糖体亚单位结合。完整的eIF4F复合体的形成需要eIF4E与其结合蛋白4EBP1的作用关系,即此时4EBP1必须是一种非结合状态。当向氨基酸缺乏的体外培养细胞中再补充氨基酸后,特别是提供亮氨酸后,4EBP1就发生高磷酸化而无法与eIF4E结合,这样就能顺利形成翻译起始因子复合体eIF4F,启动蛋白质的翻译过程。例如在动物实验中,给禁食大鼠供给蛋白质膳食或口服亮氨酸后,大鼠骨骼肌4EBP1发生高磷酸化;但是若先给禁食大鼠口服雷帕霉素rapamycin,再供给蛋白质膳食或口服亮氨酸,就能完全阻断4EBP1的高磷酸化。 2.2.2 eIF4G的磷酸化 除雷帕霉素外,胰岛素也在氨基酸调控蛋白质的翻译过程中发挥重要作用。例如给糖尿病大鼠口服亮氨酸后,能增加骨骼肌蛋白质的合成,但不能刺激糖尿病大鼠eIF4G与eIF4E的结合或4EBP1、S6K1的磷酸化。而胰岛素和氨基酸共同作用大鼠后,能完全逆转上述情况。由此推测:氨基酸作用于胰岛素,后者使PI3KPKB信号通路在低水平活化,这样胰岛素就能在一定程度上影响氨基酸对mTOR下游靶点(如eIF4E结合蛋白1、核糖体蛋白S6、eIF4G)的调控。 综上所述,氨基酸是通过多种途径如调节eIF2B活性、改变eIF4F复合体、改变rpS6的磷酸化状态等在翻译水平调节基因的表达。在这些过程中,蛋白质的翻译过程是被抑制,还是被增强,主要取决于其mRNA 5'非翻译区序列的特点。例如,在rpS6磷酸化调节机制中,那些在5'帽子结构附近含有TOP序列的mRNA会优先被翻译。而氨基酸对于mTOR下游靶点如rpS6的作用,还需要胰岛素来协助激活mTOR上游的激酶。随着mTOR作用蛋白的分离,必将有助于解决氨基酸调节基因表达的详细机制。
3 小结
氨基酸对基因表达的调控,既发生在转录水平,也发生在翻译水平。在转录水平上,氨基酸通过一些转录因子与基因启动子上的一些顺式作用元件(可能还有反式因子的作用)结合,影响基因的转录;相比之下,氨基酸在翻译水平上的调控则要复杂得多,不但涉及翻译起始因子,还涉及体内的激素(如胰岛素)、蛋白激酶等重要因子之间的交叉调控作用。但无论是转录水平还是翻译水平的调控,还有诸多的环节,如机体是如何把氨基酸信号传递给转录因子的、mTOR是通过其上游和下游的哪些因子来对氨基酸信号作出反应的等复杂的问题有待于进一步的研究和探讨。
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