周小建 王卫平 杨 毅(上海交通大学附属第一人民医院儿内科,上海 200080;复旦大学儿科医院,上海 200032) 摘要: 目的 研究视黄酸调节胸腺细胞发育的作用及其机制。方法 采用体外胸腺组织培养体系,在培养中加入视黄酸或视黄酸受体拮抗剂。在培养的不同时间收集胸腺细胞,用荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗体染色,并进行流式细胞仪分析,观察胸腺细胞表面标志随成熟分化的变化。胸腺细胞抽提的RNA采用实时定量PCR法检测视黄酸受体αRARα mRNA的表达。结果 体外胸腺组织培养体系能支持胸腺细胞的发育成熟。在培养24h视黄酸促进未成熟的CD4+CD8+胸腺细胞向CD4+成熟细胞分化发育作用明显,并且该作用可被RARα特异性拮抗剂Ro415253所拮抗。另一方面,视黄酸能显著抑制CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+细胞分化,这种作用也在培养24h出现。实时定量PCR结果显示,视黄酸能促进RARα mRNA的表达,并且RARα mRNA表达水平与CD4+CD8+胸腺细胞百分数之间存在正相关r=0.593P=0.042,与CD8+胸腺细胞百分数之间存在负相关r=-0.654,P=0.021。结论 视黄酸影响胸腺细胞的成熟分化,可能通过影响其受体RARα表达的途径而发挥调节作用。
Erpression of Retinoic Acid Receptor Genes in Children'sThumus ZHOU Xiao-jian, YANG Yi, WANG Wei-ping
Abstract Objective To study the effect and mechanism of retinoic acidRA on thymocytes maturation. Methods Thymus tissue culture system was used to investigate the roles of RA on development of thymocytes. Thymus tissues were cultured with or without retinoic acid and/or retinoic acid receptor antagonism. The cultures were harvested at 24 48 and 72 hours respectively. Thymocytes were stained with fluorescence labeled antiCD3 antiCD4 antiCD8 antibodies and analyzed by flow cytometry. The real time quantitative RTPCR assay was used to detect the retinoic acid receptor α RARα mRNA expression in thymocytes. Results The thymus tissue culture system was able to support the maturation of thymocytes. Addition of RA to the culture system promoted thymocytes differentiation from immature CD4+CD8+ cells to mature CD4+ cells but inhibited the transformation from immature CD4+CD8+ cells into mature CD8+ cells. The effect was marked at 24h and was antagonized by Ro415253. RA enhanced the expression of RARα mRNA in thymocytes. A positive correlation was found between the expression of RARα mRNA and the percent of the CD4+CD8+ cells r=0.593 P=0.042. There was a negative correlation between the expression of RARα mRNA and the percent of the CD8+ cells r=-0.654,P=0.021 by RA. Conclusion RA likely play an important role in thymocytes development perhaps by affecting the relative expression of RARα gene. Keywords Retinol;Retinoic acid receptor Thymocytes 胸腺是T淋巴细胞发育的重要场所,骨髓中的造血干细胞分化为共同淋巴样前体细胞common lymphoid precursors,CLP后进入胸腺,在胸腺微环境的作用下进一步发育为T淋巴细胞,T淋巴细胞在离开胸腺之前又称为胸腺细胞。T细胞在胸腺内的发育是胸腺细胞与胸腺微环境相互作用的结果,胸腺基质细胞通过分泌细胞因子,影响胸腺细胞的发育。视黄酸retinoic acid,RA是维生素A代谢的主要活性产物,通过与视黄酸受体retinoic acid receptorRAR结合,在脊椎动物发育、胚胎形成、细胞分化中发挥重要作用。研究证实视黄酸对免疫功能具有重要的调节作用,但对免疫细胞成熟发育的影响及其作用机理尚有待进一步研究。本研究通过观察人胸腺细胞发育过程中细胞成熟分化表面标志的变化及其与RARα mRNA表达水平的相互关系,探讨RA影响胸腺细胞发育的作用及机制。
1 材料与方法 标本来源 胸腺组织来源于我院先天性心脏病儿童在进行心脏修补手术时为暴露手术视野切除之部分胸腺,所有儿童均为单纯房缺或室缺,心功能和营养发育良好,其母怀孕期间无维生素缺乏病史。在取标本期间未接受任何影响免疫功能的治疗,如放射,激素,及免疫抑制治疗等。 主要试剂 全反式视黄酸atRA购自Sigma公司。RARα受体特异性拮抗剂Ro415253由Hoffmann La Roche Ltd.Basle Switzerland公司惠赠,以上试剂均溶于DMSO中,配成10mmolL储存液,置N2中-20°C避光保存。用于流式细胞仪检测的荧光标记的抗CD3、CD4、CD8单抗均购自PHARMINGEN公司。RNA抽提与逆转录试剂购自GIBCO公司。培养液:RPMI 1640培养液含2mmolL谷氨酰胺购自 GIBCO,含15% 56℃灭活的小牛血清,100Uml青霉素,100μgml链霉素,1mmolL丙酮酸钠。并按实验设计加入生理浓度的atRA 106molL,Ro415253 105 molL4。 胸腺标本采集与细胞悬液的制备 将手术切除的部分胸腺立即置冷RPMI 1640培养液中剪碎,采用Ficoll法分离胸腺细胞并制成细胞悬液,调成1×106·ml-1备用。采用台盼蓝摄入法检测细胞活力,至少95%以上的细胞台盼蓝染色阴性。 胸腺组织培养 参照文献5,在直径为6cm的培养皿中放入明胶海绵,并在其上置孔径为0.8μm的微孔滤膜,并将大小约1mm3的胸腺组织置滤膜上。并按加入的培养液的不同分为空白对照组control C、视黄酸组RA、RA+Ro41-5253组AO组,置37℃、5%CO2培养箱中,各组均分别培养24、48、72h并在各时间点分离收集胸腺细胞,制成细胞悬液。 细胞表面标志分析 取胸腺细胞悬液100μl,加荧光标记的抗CD4、CD8单克隆抗体染色后,并同时用荧光标记的抗CD3单克隆抗体染色作为分选指标,用流式细胞仪FACScan BD公司分析结果。 总RNA抽提及逆转录PCRReverse transcriptionPCR RT-PCR 取各时间点胸腺细胞,采用 TRIzol抽提总RNA,操作按试剂盒说明进行。抽提的总RNA用MMLVMoloney murine leukemin virus,莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶,将RNA逆转录合成cDNA。采用阳性特异性扩增产物经回收纯化和测定OD260值准确定量后,10的倍比稀释 106~1010拷贝数50ng total RNA 制备标准曲线,加入SYBR Green I dyeRoche荧光染料,进行实时定量PCR扩增,每一样本的拷贝数采用ABI7000实时定量PCR仪PerkinElmer提供的分析软件,将样本的Ct值与标准曲线比较而得到其拷贝数。视黄酸受体基因RARα的引物采用Primer Premier 5软件设计,由赛百盛生物技术公司合成,上游引物序列为5’CTGTGAGAAACGACCGAAAC3’下游引物序列为5’TTGTCCCAGAGGTCAATGTC3’产物片段长度为211bp。 数据处理 应用SPSS统计软件进行处理。采用双因素方差分析,并进行相关分析。 以均数±标准差X±s表示,P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
视黄酸对胸腺细胞发育的影响 实验中所采用的溶剂是0.1%的DMSO,在预试验中,我们采用台盼蓝染色,观察了DMSO对胸腺细胞存活率的影响,结果表明,该浓度的DMSO与正常空白 对照组相比差异无显著性。这表明微量的DMSO对体外培养体系中的胸腺细胞发育无影响。 流式细胞仪的分析结果显示对照组胸腺细胞在体外胸腺组织培养条件下可逐渐发育成熟,主要表现为,CD4+CD8+的未成熟胸腺细胞在培养过程中逐渐下降,而CD8+成熟胸腺细胞升高,以培养24h为显著。这表明体外胸腺组织培养体系能维持胸腺细胞的发育,胸腺细胞的发育须胸腺基质内环境的支持,体外培养条件下,胸腺基质细胞可能通过分泌细胞因子促进胸腺细胞成熟。 RA组CD4+CD8+胸腺细胞在培养24h并无明显下降,在培养48h后才开始下降图1,而CD8+细胞虽有所增加,但仍低于对照组P<0.05加入RARα受体特异性拮抗剂Ro415253在培养24h CD4+CD8+胸腺细胞即下降,与RA组差异有显著性P<0.05,提示RA阻抑CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+细胞的分化,而该作用可被RARα受体特异性拮抗剂抵销图2。
体外培养加入RA 24h,CD4+胸腺细胞明显增加,与对照组相比差异显著P<0.05;这种作用在加入Ro415253后则与同时间点空白对照无差异图3。这表明RA促进CD4+CD8+胸腺细胞向CD4+细胞的分化。
2.2 胸腺细胞体外培养过程中RARα mRNA的表达变化 在体外培养过程中,对照组RARα mRNA表达逐渐下降,这种趋势与体外培养体系CD4+CD8+胸腺细胞的成熟分化呈正相关变化r=0.593,P=0.042。加入RA后RARα mRNA表达在培养48h仍维持较高水平,与同一时间点对照组相比差异有显著性P<0.05;但与CD8+胸腺细胞百分数成负相关r=-0.654,P=0.021。加入Ro415253后RARα mRNA表达下降。 3 讨论
视黄酸具有广泛的生物学效应,研究表明,视黄酸通过与视黄酸受体结合而发挥作用。视黄酸受体基因表达的多样性及复杂性是视黄酸介导广泛生物学效应的分子基础6。本研究证实,胸腺细胞在分化发育的各个阶段均表达RARα mRNA。 我们结果表明,在体外培养的24~48h,视黄酸能促进胸腺细胞向CD4+胸腺细胞分化,这种作用在培养24h尤为明显;另一方面,RA显著抑制胸腺细胞向CD8+胸腺细胞分化,这种变化与视黄酸对RARα mRNA表达的影响相一致,并且在加入RARα特异性拮抗剂Ro415253后能抵消上述作用,这表明,RA是通过与RARα结合而发挥调控胸腺细胞发育的作用。 既往研究认为7,RARα主要在胸腺细胞发育的CD4+CD8+阶段表达,我们通过实时荧光定量PCR法测定不同时间点RARα mRNA表达的变化,结果发现,体外培养过程中RARα mRNA表达逐渐下降,这与CD4+CD8+胸腺细胞的下降相一致,这提示CD4+CD8+细胞可能是RA作用的主要靶细胞。因此,我们认为,通过影响CD4+CD8+胸腺细胞RARα mRNA的表达,可能对调节CD4+CD8+细胞的分化具有重要作用。
本研究还发现,加入RA后CD4+CD8+胸腺细胞与对照组相比显著升高,这表明RA能抑制CD4+CD8+胸腺细胞的分化成熟,但此时CD4-CD8-胸腺细胞并无明显变化,CD4+胸腺细胞升高,故我们认为,这种作用主要是抑制了CD4+CD8+胸腺细胞向CD8+胸腺细胞分化。可见,RA一方面促进CD4+CD8+胸腺细胞向CD4+胸腺细胞分化;另一方面,又抑制其向CD8+胸腺细胞分化,RA对不同分化阶段胸腺细胞的作用的不同可能源于其RARα mRNA表达的差异。 研究证实,CD4+CD8+胸腺细胞表达CD4及CD8协同受体分子,是一种未成熟的双向的前体细胞,具有向CD4+CD8-或CD8+CD4-单阳性成熟T细胞分化的能力,这主要取决于TCRT cell receptor,T细胞受体的MHCmajor histocompatibility complex,主要组织相容性复合物特异性, CD4+CD8+胸腺细胞表达MHCII类特异性TCR则分化为CD4+胸腺细胞,若表达MHCI类特异性TCR则分化为CD8+胸腺细胞8。Yagi等7研究发现RA显著抑制CD4-CD8-胸腺细胞及CD4+CD8+胸腺细胞的CD3及TCR基因表达的上调,因此,我们推测,RA可能通过其受体途径影响TCR、MHC基因的表达从而影响T淋巴细胞发育。另一方面,有研究认为,胸腺早期发育过程中表达的一些细胞因子或某些蛋白可影响CD4+CD8+胸腺细胞分化910。因此,RA是否通过其受体途径影响这些细胞因子或蛋白的表达,从而间接调控T细胞发育尚需进一步研究。 本研究主要观察RARα途径的活化与阻抑对胸腺细胞成熟的作用。由于视黄酸受体尚有其它的亚型,研究表明,不同的视黄酸受体亚型具有不同的生理功能,胸腺细胞在发育过程中还表达RARγ、RXRα等。Szondy等11认为RARα的表达与活化能抑制胸腺细胞凋亡,而RARγ途径则诱导胸腺细胞凋亡。该研究认为,生理浓度的全反式视黄酸atRA并不影响活化诱导的胸腺细胞凋亡,这是由于RARα与RARγ处于相对平衡,若增加atRA浓度,使其在体内转化为9顺式视黄酸,则激活RXRs,加强了RARα的抑制作用,抵消RARγ介导的促凋亡作用。这表明,通过精确调节RARs表达,导致RARαRARγ表达比值的变化可影响细胞的发育。因此,进一步对其它视黄酸受体的深入研究,有利于我们理解视黄酸调控胸腺细胞发育的确切机制。 总之,RA对胸腺细胞发育具有重要的调节作用, RARα特异性拮抗剂Ro415253能拮抗这种作用,提示RA可能通过RARα途径发挥调节胸腺细胞发育的作用。由于T细胞在细胞免疫以及活化辅助B细胞产生抗体的过程中均发挥重要作用,本研究显示,视黄酸受体α途径的活化在促进CD4+细胞的发育中起重要作用,这为临床合理使用维生素A制剂增强儿童免疫功能提供了理论依据。
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