杨 红 杨 毅 王卫平(上海医科大学儿科医院儿保科及儿研所,上海 200032) 摘要:目的 研究视黄酸(RA)促进脐血淋巴细胞(CBL)细胞因子表达的作用途径,探讨视黄酸受体α在该过程中的可能作用。方法 收集19例健康新生儿的脐血标本进行体外培养,采用RTPCR法检测CBL中视黄酸受体α(RARα)、IL2、IFNγ和IL4的mRNA水平。结果 RA上调CBL中RARα的基因表达水平,培养24h时的上调幅度为(1.17±0.07)倍(P<0.001)。RA上调IL2的基因表达水平,培养24h时的上调幅度为(1.29±0.20)倍P<0.001)。RA也上调IFNγ的基因表达水平,培养48h时的上调幅度为(1.39±0.26)倍P<0.001)。RA还上调IL4的基因表达水平,培养24h时的上调幅度为(1.52±0.44)倍P<0.002)。RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IL2、IFNγ和IL4基因表达的上调幅度皆存在正相关,r 值分别为0.40、0.39和0.46P<0.05。结论 RARα可能参与RA对CBL细胞因子(IL2、IFNγ和IL4)表达的促进作用。RA可能通过增加RARα的表达而上调IL2、IFNγ及IL4等细胞因子的表达,从而促进CBL的功能。 关键词:视黄酸受体;基因表达;胎血;淋巴细胞;细胞活素类
Abstract:Objective To explore the path of retinoic acid RApromoting cytokine expressions in cord blood lymphocytesCBL. Methods Nineteen cord blood sanples from healthy newborns were collected and CBL were cultured in vitro. The mRNA levels of retonoic acid receptorαRARα,IL2,IFNγ and IL4 were determined by reverse transcriptionpolymerase chain reactionRTPCR. Results The RARα expression was increased with the optimal concentration of RA the enhanced amplitude was1.17±0.07times after culture for 24 hours(P<0.001). The expression of IL2 was augmented by RA,the enhanced amplitude was(1.29±0.20)times after culture for 24 hoursP<0.001). The expression of IFNγ was augmented by RA the enhanced amplitude was(1.39±0.26)times after culture for 48 hoursP<0.001). The expression of IL4 was augmented by RA,the enhanced amplitude was(1.52±0.44)times after culture for 24 hoursP<0.002). There were positive correlations between the enhanced amplitude of RARα expression and the enhanced amplitudes of IL2、IFNγ and IL4 expressions,r=0.40 0.39 0.46respectivelyP<0.05. Conclusion RARα might be involved in the promotive cytokine expressions in CBL by RA.
Keywords Retinoic acid receptors;Gene expression Fetal blood Lymphocytes Cytokines
许多研究表明类维生素A能够促进免疫细胞的功能1, 但其作用途径和机制有待进一步阐明。这些年细胞因子的作用日益受到重视,本研究采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR)技术,检测类维生素A代表分子——视黄酸(retinoic acid,RA)对脐血淋巴细胞(cord blood lymphocytes,CBL)中视黄酸受体α(retinoic acid receptorα, RARα)和一些细胞因子基因表达水平的调节,以探讨RA对脐血淋巴细胞细胞因子表达的促进作用是否通过RARα调节的途径。
1 材料与方法
1.1 淋巴细胞体外培养 脐血获自上海市金山区金卫乡卫生院母婴健康的顺产新生儿,分离单核细胞后,用RPMI1640培养液(GIBCO产品)悬浮细胞为106ml,培养在96孔U型板中,加入PHA(上海市医学化验研究所产品),深度为50mgL;视黄酸(RA,Sigma公司产品),浓度为1×10-6molL 在培养6、24、48和72h后分别收获细胞,留置未培养的单核细胞作为对照。 1.2 RTPCR检测RARα、IL2、IFNγ和IL4mRNA 1) 总RNA抽提 培养前后的脐血淋巴细胞采用TRIzo1试剂(GIBCO产品)提取制备总RNA,用紫外分光光度计(日本岛津UV1601)测定A 260进行准确定量。 2) 引物设计 参考国外文献并采用计算机辅助设计,引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。 3)RTPCR 取1μg总RNA经逆转录酶(GIBCO产品)催化合成cDNA第1链,并以此为模板进行PCR扩增,取扩增产物10μl琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果并照相(英国UVP公司紫外凝胶成像及分析仪)。 1.3 结果分析与显著性检验 采用紫外凝胶成像及分析系统(英国UVP公司)对电泳凝胶中的PCR产物条带进行定量分析。配对资料比较的显著性检验采用配对 t 检验,直线相关系统的显著性检验根据 r 值直接查 r 界值表。
2 结果
2.1 RA对体外培养的CBL中RARα基因表达的调节 CBL在PHA刺激下,RAR基因表达水平很快升高,24h达高峰。加入RA共同培养后即观察到RA对RARα表达的显著上调。培养24h时上调幅度为(1.17±0.07)倍t=4.848 P<0.001。 2.2 CBL中细胞因子基因表达的调节及其与RARα mRNA水平变化的相关性 CBL在PHA刺激下,IL2基因表达水平很快升高,24h达到高峰。加入RA共同培养后即出现RA对IL2表达的显著上调,培养24h时的上调幅度为(1.29±0.20)倍t=5.483 P<0.001。分析RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IL2基因表达的上调幅度发现存在正相关关系r=0.40 P<0.05图1。
CBL在PHA刺激下,IFNγ基因表达水平逐步升高,48h达到高峰。加入RA共同培养后即出现RA对IFNγ基因表达的显著上调,培养48h时的上调幅度为(1.39±0.26)倍t=4.688 P<0.001。分析RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IFNγ基因表达的上调幅度发现存在正相关关系r=0.39 P<0.05图2。
CBL在PHA刺激后,IL4基因表达水平很快升高,24h达到高峰。加入RA共同培养后即出现RA对IL4表达的显著上调,培养24h时的上调幅度为(1.52±0.44)倍t=3.770 P<0.002。分析RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IL4基因表达的上调幅度发现存在正相关关系r=0.46 P<0.05图3。
3 讨论
许多研究表明类维生素A是一类重要的免疫功能调节剂,对T、B淋巴细胞的活化、增殖和分化具有重要的调节作用1。在类维生素A促进T、B淋巴细胞功能的机制研究中,细胞因子的作用日益受到重要。已发现受类维生素A调节表达的细胞因子包括IL4、IL2、IL3、IL1、IL6、IL10、IFNγ、TGFβ及TNFα等25。 细胞因子参与免疫应答的全过程,在参与免疫应答的T、B等淋巴细胞间进行信息传递。TH1类细胞因子(IL2、IFNγ等)和TH2类细胞因子(IL4)等对T、B细胞功能具有重要的调节作用。本研究表明RA使体外活化CBL中IL2、IFNγ及IL4的mRNA表达水平明显升高,揭示RA能够通过上调TH1、TH2类细胞因子的表达,从而促进CBL的功能。但是RA通过何种途径调节细胞因子的表达,尚有待阐明。1987年视黄酸受体(RARs)的发现6,大大促进并深化了对维生素A增强免疫功能的机制研究。视黄酸受体属于类固醇甲状腺激素核内受体超家族成员,包括3种亚型:RARα、RARβ和RARγ。其中RARα在细胞中的表达最为广泛。近几年来,我们既往的研究发现7人外周血淋巴细胞中主要表达RARα,且RARα基因的转录表达受线裂原和RA的调节。本研究再次表明RA上调PHA活化CBL中RARα基因表达水平,提示RARα可能参与RA对淋巴细胞的调节功能。RARα是类维生素A依赖的转录因子,位于细胞核内基因转录的调控区,受其调节的基因有50余种,包括RARβ、层粘蛋白B1和垂体生长激素等基因8。本研究发现,RA上调RARα基因表达幅度与RA上调IL2、IFNγ及IL4基因表达幅度间皆存在正的相关关系,提示RARα可能参与RA对CBL细胞因子表达的促进作用。RA可能通过增加RARα的表达而上调IL2、IFNγ及IL4等细胞因子的表达,从而促进CBL的功能。 儿童的维生素A营养水平与其免疫功能的关系日益受到临床医生的重视,研究表明适量维生素A营养能够促进儿童免疫系统的发育和功能。进一步阐明维生素A促进T、B淋巴细胞功能的作用机制,将为在儿童中开展维生素A补充干预试验提供理论和实验依据,也能为治疗其他免疫缺陷病提供新的途径。
参考文献:
1. Semba RD. The role of vitamin A and related retinoids in immune function. Nutr Rev. 1998 56 S38-48. 2. Cantorna MT Nashold FE Hayes CE. In vitamin A deficiency multiple mechanisms establish a regulatory T helper cell imbalance with excess Th1 and insufficient Th2 function. J Immunol. 1994 15241515-1522. 3. Ballow M Xiang S Greenberg SJ et al. Retinoic acidinduced modulation of IL2 mRNA production and IL2 receptor expression on T cells. Int Arch Allergy Immunol. 1997 1131-3167-169. 4. Ballow M Xiang S Wang W et al.The effects of retinoic acid on immunoglobulin synthesis role of interleukin 6. J Clin Immunol. 1996163171-179. 5. Carman JA Hayes CE. Abnormal regulation of IFNgamma secretion in vitamin A deficiency. J Immunol. 1991 14741247-1252. 6. Petkovich M Brand NJ Krust A Chambon P. A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors. Nature. 1987 3306147444-450. 7. 王卫平 杨毅 苏贻新. 人外周血淋巴细胞视黄酸受体基因的表达与调控. 营养学报 1998 20270-285. 8. Hashimoto Y. Retinobenzoic acids and nuclear retinoic acid receptors. Cell Struct Funct. 1991 162113-123. |