杨 红 杨 毅 王卫平 姚海丽(上海医科大学儿科医院儿保科及儿研所,上海 200032) 摘要:目的 研究视黄酸(RA)促进脐血淋巴细胞(CBL)抗体生成的作用机制。方法 对脐血标本进行血清维生素A(VA)浓度测定,采用RTPCR法检测CBL中视黄酸受体α(RARα)的基因表达水平,并采用EL ISA法检测细胞培养上清液中IgM含量。结果 脐血血清VA水平与未培养CBL中RARα的基因表达水平之间存在正相关r=0.50P<0.01;RA增加金黄色葡萄球菌Cow an I株(SAC)活化CBL的IgM生成能力(P<0.001);RA上调SAC活化CBL中RARα的基因表达水平(P<0.001; RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度之间存在正相关:r=0.04P<0.05。结论 RA对CBL抗体生成的促进作用可能通过RARα途径传递。 关键词:视黄酸受体;基因表达;脐血淋巴细胞;抗体生成
Role of retnoic acid receptor in antibody synthesis of cord blood lymphocytes YANG Hong WANG Weiping YANG Yi YAO HailiChildren’s Hospital of Shanghai Medical University Shanghai 200032China
Abstract:Objective To further explore the mechanism by which retinoic acid RApromotes the antibody production of cord blood lymphocytesCBL. Methods The levels of serum vitamin A in cord blood were measured. The expression of retinoic acid receptorαRARαgene was determined by RTPCRreverse transcriptionpolymerase chain reaction. The IgM concentrations in the supernatants of cell culture were measured by EL ISA. Results A positive correlation was found between serum vitamin A level and RARα expression level in uncultured CBL r=0.50P<0.01. IgM synthesis of SACactivated CBL was augmented by RAP<0.001. RARα expression level of SACactivated CBL was increased by RAP<0.001. RARα expression level of SACactivated CBL was increased by RAP<0.01. There was a positive correlation between the enhanced amplitude of RARα expression and the enhanced amplitude of IgM synthesis by RA r=0.40P<0.05. Conclusion Our studies suggest that RARα pathway perhaps is one of main ways by which RA promotes antibody production of CBL. Keyword retinoic acid receptorα gene expression cord blood lymphocytes antibody production
近些年的研究已证实维生素A(VA)对免疫系统,对T、B淋巴细胞功能具有调节作用1。VA的主要活性产物——视黄酸(retinoic acid,RA)能促进体外培养的脐血单个核细胞产生免疫球蛋白2,但其作用途径和机制有待进一步阐明。为此,我们测定了脐血血清VA水平,并采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpo lymerase chain reaction,RTPCR)技术,检测分析RA对脐血淋巴细胞(cord blood lym phocytes,CBL)中视黄酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)基因表达水平的调节,以探讨RA对脐血淋巴细胞抗体生成能力的促进作用是否通过RARα调节的途径。
1 材料与方法
1.1 脐血血清VA测定 脐血获自上海市金山区金卫乡卫生院母婴健康且营养状态良好的顺产儿,本研究参考刘继鹏等的方法,采用微量荧光分光光度法测定脐血血清VA浓度。 1.2 淋巴细胞体外培养 脐血分离单个核细胞后,用含15%小牛血清GBCO产品的RPMI1640培养液GBCO产品悬浮细胞为106mL,培养在96孔U型板中,加入SAC(CALBDCHEM产品),浓度为1∶1 800;视黄酸(RA,Sigma公司产品)浓度1×106molL,在培养24h后收获细胞,留置未培养的单个核细胞作为对照。培养7d后收集细胞上清液进行IgM含量测定。 1.3 RTPCR检测RARαmRNA 1.3.1 总RNA抽提:培养前后的脐血淋巴细胞采用TR Izo1试剂(GBCO产品)提取制备总RNA,用紫外分光光度计(日本岛津UV1601)测定波长为260nm时的OD值进行准确定量。 1.3.2 引物设计:参考国外文献资料并采用计算机辅助设计,RARα的上下游引物分别为5’GCGGGCACCTCAATGGGTAC3’和5’GGACATGCCCACTTCAAAGC3’。引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。 1.3.3 RTPCR:取1μg总RNA经MMLV逆转录酶(GBCO产品)催化合成cDNA第一链,并以此为模板进行PCR扩增,取扩增产物10μl走2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果并照相(英国)UVP公司紫外凝胶成像及分析仪)。 1.4 细胞上清液中IgM含量的测定 采用EL ISA双抗夹心法检测上清液中IgM含量。 1.5 结果分析与显著性检验 采用紫外凝胶成像及分析系统英国UVP公司对电泳凝胶中的PCR产物条带进行定量分配对资料比较的显著性检验采用配对r检验直线相关系数的显著性检验根据r 值直接查r 界值表。
2 结果
2.1 脐血血清VA水平及其与CBL中RARα基因表达水平的相关性 脐血血清VA水平的平均值为1.06±0.35μmolL。对脐血血清VA水平与未培养CBL中RARα的基因表达水平之间作相关分析发现,两者之间存在显著正相关r=0.50,P<0.01图1。
2.2 RA对体外培养CBL的IgM生成能力的促进作用 RA1×106molL增加SAC刺激的CBL的IgM生成能力,由0.44±0.36mgLSAC刺激增加到1.20±0.72mgLSAC+RA共同培养r=6.096 P<0.001,图2)。
2.3 RA对体外培养的CBL中RARα基因表达的调节 CBL在单纯SAC刺激培养24h后,RARαmRNA水平为未培养时的1.21±0.18倍,加入RA与SAC共同培养24h后,CBL中RARα的mRNA水平增加至未培养时的1.45±0.22倍,RA对RARαmRNA水平的上调具有显著性意义r=6.025,P<0.001,图3。
2.4 CBL中RARα基因表达水平与IgM合成水平受RA上调幅度之间的相关性 RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度间存在正相关关系:r=0.40,P<0.01图4。
3 讨论
自VA被发现以来,人们就观察到VA具有抗感染作用。Scrinshaw指出“与VA缺乏相比,没有一种其他营养素的缺乏与感染性疾病之间具有更密切的相关关系”4。VA通过其免疫调节作用而发挥抗感染作用。类VA对T、B淋巴细胞的活化、增殖及分化具有重要的调节功能1。本研究表明类VA的代表分子——RA能够促进体外培养的CBL的IgM生成能力,但其作用途径和机制需进一步阐明。 1987年视黄酸受体(RARs)的发现5,大大促进并深化了对VA增强免疫功能的机制研究。RARs属于类固醇甲状腺激素核内受体超家族成员,包括3种亚型:RARα、RARβ及 RARγ6。近年来,我们观RARα基因的转录表达受丝裂原和RA调节。 本研究观察到脐血血清VA水平越高,RARα的表达水平也越高,两者之间存在显著正相关。 本研究表明RA能够上调SAC活化CBL中RARα的基因表达,并且RA使RARα基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度之间存在正相关关系,提示RA对CBL的IgM生成的促进作用可能通过RARα途径传递。
参考文献:
1. Semba RD. The role of vitamin A and related retinoids in inmune function. Nutr R ev 1998 561∶s38-s48. 2. Wang W Ballow M. The effects of retinoic acid on in vitro inmunoglobulin synthesis by cord blood and adult peripheral blood mononuclear cells. Cell Immunol 1993 148∶291-300. 3. 刘继鹏奚金宝阎志等.血清维生素A微量荧光测定法的改进和应用. 营养学报 1985 7∶136-140. 4. Scrinshaw NS Taylor CE Gordon JE Interactions of nutrition and infectionA. Geneva∶ World Health Organization1968. 5. Martin P Nigel B Andree K et al. A Human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptor. Nature 1987 330∶444-450. 6. Yuichi Hashinoto. Retinobenzoic acids and nuclear retinoic acid receptors. Cell Struct Funct 199116∶113-123. 7. 王卫平 杨毅 苏贻新. 人外周血淋巴细胞视黄酸受体基因的表达与调控. 营养学报 1998 20∶275-280. |